某些含水量低且不易變形的生物材料，可以不經(jīng)固定和干燥而在較低加速電壓下直接觀察，如動物毛發(fā)、昆蟲、植物種子、花粉等，但圖象質(zhì)量差，而且觀察和拍攝照片時須盡可能迅速。對大多數(shù)的生物材料，則應(yīng)首先采用化學(xué)或物理方法固定、脫水和干燥，然后噴鍍碳與金屬以提高材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額。  

 

化學(xué)方法制備樣品  

化學(xué)方法制備樣品的程序通常是：清洗、化學(xué)固定、干燥、噴鍍金屬。  

1、清洗：某些生物材料表面常附血液、細(xì)胞碎片、消化道內(nèi)的食物殘渣、細(xì)菌、淋巴液及粘液等異物，掩蓋著要觀察的部位，因而，需要在固定之前用生理鹽水或等滲緩沖液等把附著物清洗干凈。亦可用5%碳酸鈉沖洗或酶消化法去除這些異物。  

2、固定：通常采用醛類(主要是戊二醛和多聚甲醛)與四氧化鋨雙固定，也可用四氧化鋨單固定。四氧化鋨固定不僅可良好地保存組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而且能增加材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，提高掃描電子顯微圖象的質(zhì)量。這對高分辨掃描電子顯微術(shù)是很重要的。為增強這種效果，可用四氧化鋨-單寧酸或是四氧化鋨-珠叉二胼等反復(fù)處理材料，使其結(jié)合更多的重金屬鋨，這就是導(dǎo)電染色。  

3、干燥：固定后通常采用臨界點干燥法。其原理是：適當(dāng)選擇溫度和壓力，使液體達(dá)到臨界狀態(tài)(液態(tài)和氣相間界面消失)，從而避免在干燥過程中由水的表面張力所造成的樣品變形。對含水生物材料直接進行臨界點干燥時，水的臨界溫度和壓力不能過高(37.4℃，218帕)。通常用乙醇或丙酮等使材料脫水，再用一種中間介質(zhì)，如醋酸戊酯，置換脫水劑，然后在臨界點干燥器中用液體或固體二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置換劑置換中間介質(zhì)，進行臨界干燥。  

4、噴鍍金屬：將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺上，然后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50～300埃厚的金屬膜，以提高樣品的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額，改善圖象質(zhì)量，并且防止樣品受熱和輻射損傷。如果采用離子濺射鍍膜機噴鍍金屬，可獲得均勻的細(xì)顆粒薄金屬鍍層，提高掃描電子圖象的質(zhì)量。  

 

冷凍方法制備樣品  

低溫掃描電子顯微術(shù)是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的方法。它包括生物樣品的冷凍固定、冷凍干燥、冷凍割斷和冷凍含水樣品的掃描電子顯微術(shù)等。  

1、冷凍固定：將生物材料投入低溫的致冷劑中，如液氦、液氮、液體氟利昂及丙烷等。快速冷凍可使生物組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成接近于生活狀態(tài)。被冷凍固定的生物樣品，可以在低溫條件下轉(zhuǎn)移到具有低溫樣品臺的掃描電子顯微鏡中直接觀察無需進一步處理或僅在冷凍樣品表面噴鍍一薄層金屬。這種方法不僅快速簡便，而且可以排除由于干燥法造成收縮的假象，特別適合于研究含水量很高的生物材料。  

2、冷凍干燥：生物樣品經(jīng)冷凍固定后，其中的水分凍結(jié)成冰，表面張力消失；再將冷凍樣品放于真空中，使冰漸漸升華為水蒸氣。這樣獲得的干燥樣品在一定程度上避免了表面張力造成的形態(tài)改變。